中国苹果炭疽病病原菌的遗传多样性

【摘要】苹果炭疽病是苹果上一种主要病害，引起大量落果或落叶，贮藏期果实腐烂，给果农及消费者造成巨大的经济损失。本研究对我国辽宁、山东、河南和陕西等苹果主产区苹果炭疽病的病原菌进行了系统鉴定和分类研究，分析了不同地区苹果炭疽病病原菌的群体遗传多样性及构成，对果园周边相关寄主的炭疽病病原菌进行系统鉴定并分析其在苹果炭疽病发生中的作用，取得了以下主要结果。1.从2010～2012年自中国辽宁、山东、河南和陕西等苹果主产区采集了苹果炭疽病标样285份，分离纯菌株98株，对其形态学、分子系统学和致病性进行分析。对分离的苹果炭疽病病原菌进行内转录间隔区序列（ITS）、肌动蛋白（ACT）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、几丁质酶（CHS-1）和β-微管蛋白2（TUB2）单基因及多基因联合的系统发育分析，综合形态学鉴定结果，确定我国苹果炭疽病病原菌可分为7个分类单元，包括已知种6个，新种1个，其中引起果实苦腐病的病原有6个种，分别为：异国刺盘孢C.alienum、果生刺盘孢C.fructicola、胶孢刺盘孢C.gloeosporioides、睡莲刺盘孢C.nymphaeae、暹罗刺盘孢C.siamense和新种—东方刺盘孢C.orientalis，从菌株分离率来说，占总菌株数62.2%的暹罗刺盘孢C.siamense是优势种；苹果炭疽叶枯病的病原分两个种：包括隐秘刺盘孢C.aenigma和果生刺盘孢C.fructicola，其中果生刺盘孢C.fructicola是优势种。致病性测定显示7个种的菌株有伤接种果实均能发病，分自苹果苦腐病症状的6个种的菌株无伤接种也均可致病，并在果面产生典型的苦腐病症状；不同种的致病力存在差异，异国刺盘孢C.alienum的菌株F11PGZH02致病力最强（发病率100%）；分自苹果叶枯病症状的两个种的菌株无伤接种富士苹果都不发病，但接种秦冠苹果都发病，显示不同品种的苹果对炭疽叶枯病菌的抗性存在显著差异。2.为了探讨苹果炭疽病病原菌的群体遗传多样性和群体遗传结构，本研究采用正交试验对ISSR-PCR反应体系进行优化，并利用优化的体系对35条ISSR通用引物进行了筛选，利用筛选的10条多态性引物和优化的ISSR-PCR反应体系对我国不同地理来源的67株刺盘孢菌株进行ISSR聚类分析，10条引物共扩增出65个位点的多态性条带，多态率100%。物种水平的聚类分析结果显示，在遗传相似系数0.76水平时，代表性刺盘孢菌株可区分为7个亚群，分别对应于多基因分析中的隐秘刺盘孢C.aenigma、异国刺盘孢C.alienum、果生刺盘孢C.fructicola、胶孢刺盘孢C.gloeosporioides、东方刺盘孢C.orientalis、睡莲刺盘孢C.nymphaeae和暹罗刺盘孢C.siamense。说明ISSR分子标记对刺盘孢属具有良好的种间及种内区分性，非常适于对炭疽病病原菌遗传多样性的研究。通过对不同地理来源的67株苹果炭疽病病原菌菌株的群体遗传多样性的分析发现，Nei’s基因多样性指数（H）均大于0.2水平，Shannon信息指数（I）也均大于0.3水平，证明我国苹果炭疽病病原菌具有丰富的遗传多样性。通过对三个地理种群的遗传结构分析发现，遗传分化系数（Gst）显示渤海湾区最高，说明渤海湾区的遗传多样性最为丰富，内部的遗传分化较大，但毎代迁移数Nm<1，说明种群内的基因交流受到抑制；而后两个地区黄河故道区和西北高原区的Gst值都较小但种群的毎代迁移数Nm较大，说明这两个种群遗传分化较小，种群遗传变异主要来自于群落内，种群内都存在丰富的基因交流。综合三个地理种群毎代迁移数Nm=0.72，说明三个地区之间存在一定的菌源交流。3.自2011～2012年从陕西不同地区采集的蔷薇科、豆科、茄科等植物上具有炭疽病病症的标样85份，共分得刺盘孢菌株41株，选取21株菌株构建ITS的系统发育树，结果显示21个果园周边寄主的炭疽病病原菌可初步分为8个类群，选取其中可能与苹果炭疽病病原菌分类相同的5株代表性菌株进行多基因系统发育树的构建，结果表明从梨、辣椒和猕猴桃上分到的部分刺盘孢菌株与分自苹果的刺盘孢菌株分类相同，说明胶孢刺盘孢C.gloeosporioide和果生刺盘孢C.fructicala的菌株除可侵染苹果，还可侵染猕猴桃、辣椒和梨等寄主。按照同样方法对21株果园周边寄主的炭疽病病原菌进行ISSR-PCR扩增，聚类分析显示，在相似系数0.68处，29株菌株可分为8个类群，与ITS和多基因系统发育分析结果基本一致。对其中6个分类单元的10株菌株在苹果上进行致病性测定，结果显示所有菌株有伤接种均可发病；而归属为尖孢刺盘孢C.acutatum、猪毛菜刺盘孢C.salsolae和西蒙德刺盘孢C.simmondsii的菌株无伤接种不能发病，证明它们对苹果没有致病性；而分别归属于果生刺盘孢C.fructicola、胶孢刺盘孢C.gloeosporioides和松针刺盘孢C.fiorinae的菌株无伤接种都可以发病，并显示典型苹果炭疽病症状，说明它们对苹果均具有致病性，进一步证明果园周边梨、辣椒和猕猴桃等寄主可以作为苹果炭疽病潜在的初侵染源。本研究首次系统地对苹果炭疽病病原菌进行分离和鉴定，通过国际上最新的多基因系统分类学与形态学相结合的多相分类技术明确我国苹果炭疽病病原菌构成。本研究发现ISSR分子标记作为核苷酸序列分析辅助手段，不但可以区分刺盘孢属种间遗传分化，还可以区分种内遗传分化，适宜于对炭疽病病原菌的群体遗传多样性、群体遗传结构和菌源传播关系等方面的研究。利用多基因分析、ISSR分子标记和致病性测定等多方面综合分析证明果园周边寄主可以作为苹果炭疽病潜在初侵染来源，为炭疽病的有效防治提供了理论基础。
【作者】符丹丹；
【导师】孙广宇；
【作者基本信息】西北农林科技大学，植物病理学，2014，博士
【关键词】刺盘孢属；苹果炭疽病；多基因系统学；ISSR分子标记；致病性测定；

【参考文献】
[1]单丽辉.基于耗散结构的物流网络系统运作模式与运行机制研究[D].北京交通大学,2012.
[2]杜晓雯.新型磁性分子印迹材料用于强致癌有机污染物痕量残留的分析方法研究[D].宁波大学,2014.
[3]李春梅.基于网络的入侵检测系统的研究及实现[D].西安电子科技大学,2005.
[4]崔凯婷.韩国忠清北道清州市5所中学汉语教学调查与研究[D].兰州大学,汉语国际教育,2013,硕士.
[5]史宇.硬质合金可转位刀片的可靠性灵敏度与可靠性稳健设计[D].东北大学,机械设计及理论,2010,硕士.
[6]吕丹.大学生社会主义核心价值体系教育校园文化载体建设研究[D].西南大学,思想政治教育,2013,硕士.
[7]张学兵.试析奥巴马政府的阿富汗政策[D].新疆大学,国际政治,2013,硕士.
[8]程南.群体动力视角下的煤矿员工不安全行为管理研究[D].中国矿业大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[9]昝廷全,胡雅梅.系统经济学名词解释(Ⅲ)[J].中国传媒大学学报(自然科学版),2014,05:66-76+42.
[10]李琳,周霞,罗剑波,赵娟,宋锦海,李威.适用于频率安全稳定的低频切泵及减载协调优化方法[J].电力系统自动化,2012,13:26-31.
[11]周晓峰.手助腹腔镜与开放肾脏肿瘤手术的比较研究[D].浙江大学,外科学,2004,硕士.
[12]张鑫鑫.生物序列数据K-mer频次统计与可视化研究[D].中国科学技术大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[13]谢阳.詹姆斯·科纳设计思想及作品解析[D].重庆大学,设计艺术学,2014,硕士.
[14]何东.风电场功率预测及日前调度计划研究[D].哈尔滨工业大学,电气工程,2013,硕士.
[15]乔永平.危旧双曲拱桥的计算方法分析[D].广西大学,结构工程,2004,硕士.
[16]蔡兴.基于多元智能理论的初中英语词汇教学中英文歌曲的研究[D].河北师范大学,学科教学,2013,硕士.
[17]张乐,井元伟.基于非脆弱控制器设计的不确定模糊系统稳定性研究[J].控制与决策,2007,03:329-332.
[18]张志让,张振平.一种减少偏移画弧的方法──同相叠加[J].石油地球物理勘探,1999,04:436-441+490.
[19]赵静.慢性乙肝病毒感染者I型干扰素受体与机体氧化应激状态的相关性研究[D].山东大学,内科学,2013,硕士.
[20]王克忠,程青云,王玉培,林峰,沈一涛.粉质砂性土地基中盾构区间隧道开挖过程数值计算研究[J].浙江工业大学学报,2012,05:587-590.
[21]段志奇.兰州银行员工绩效考核体系优化研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[22]林宁.养阴清热法对MRL/lpr狼疮鼠调节性T细胞、Th17细胞和肾脏病理的作用[D].广州中医药大学,中医临床基础,2014,博士.
[23]蒋许林.对外汉语临时名量词教学研究[D].安徽大学,汉语国际教育,2014,硕士.
[24]施图万,陈建辉,吴孝松,俞大鹏.蓝宝石上石墨烯的近程催化生长研究[J].电子显微学报,2013,05:365-371.
[25]侯学文.卫生检验机构资质认定管理体系运行现状及其量化自评方法研究[D].山东大学,公共卫生（专业学位）,2013,硕士.
[26]廉捷,周欣,曹伟,刘云.新浪微博数据挖掘方案[J].清华大学学报(自然科学版),2011,10:1300-1305.
[27]邓珍珍.关于《许茂和他的女儿们》的两种改编[D].西南大学,电影学,2014,硕士.
[28]杨玉灿.综合性大学校园植物景观美学评价[D].西南大学,花卉学,2014,硕士.
[29]霍纬纲,高小霞.一种适用于多类不平衡数据集的模糊关联分类方法[J].控制与决策,2012,12:1833-1838.
[30]孙福泽.云环境下软件的自动配置模型与方法研究[D].杭州电子科技大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[31]朱一苗,施小宇,姜招嫦,潘文胜.早期原发性十二指肠腺癌1例报道并文献回顾[J].实用肿瘤杂志,2014,04:357-360.
[32]周汉坤.基于无机纳米复合量子点材料构建的电致化学发光免疫传感器研究[D].宁波大学,2013.
[33]童芳莉.PTD4-Apoptin融合蛋白对人源非小细胞肺癌抑瘤效应的研究[D].华中科技大学,生物化学与分子生物学,2012,硕士.
[34]段敏芳.市场调查实践课调查方案设计与数据分析[J].统计教育,2005,10:15-18.
[35]朱雪枫.五自由度上肢康复机器人数学建模与仿真[D].东北大学,控制理论与控制工程,2011,硕士.
[36]陆洋.直接三维ECT传感器结构参数优化研究[D].沈阳工业大学,检测技术与自动化装置,2013,硕士.
[37]李红梅,卢苇,陈旭东,邢薇薇.毕业实习与设计过程管理质量保证体系的研究与实践[J].高等工程教育研究,2012,06:167-171.
[38]张丽杰.高产海藻糖菌株的诱变育种、培养基优化及提取纯化的研究[D].河北工业大学,化学工艺,2004,硕士.
[39]潘辰苑.环境内分泌干扰物在鱼胆汁中的检测及其诱导斑马鱼胚胎细胞凋亡的研究[D].上海大学,环境工程,2014,硕士.
[40]杨海梅.影响学业自立的家庭因素：小学生个案研究[D].曲阜师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[41]李沣泰.高层建筑框架—核心筒混合结构地震能量反应及损伤评估[D].西安建筑科技大学,结构工程,2013,硕士.
[42]成华丽.LED衬底及外延专利分散测量与对策研究[D].华中科技大学,知识产权管理,2012,硕士.
[43]王睿.S通信分公司服务质量改善案例研究[D].大连理工大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[44]潘虎.中国式管理型医疗初探[D].清华大学,公共管理,2003,硕士.
[45]王靖宇.重大工程项目社会稳定风险评估机制研究[D].吉林大学,公共管理,2013,硕士.
[46]周爱舫.建设银行邯郸分行现金管理业务发展研究[D].河北大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[47]李勇.大枣枣皮红色素的分离、生物活性及稳定性的研究[D].郑州大学,应用化学,2013,硕士.
[48]陈斌.东坡词历代传播与接受研究四题[D].苏州大学,中国古代文学,2014,硕士.
[49]何常香.p～6阶群（φ_（13）,φ_（24）,φ_（25）φ_（26））的自同构群的阶[D].广西大学,基础数学,2004,硕士.
[50]习飘飘.集体土地上房屋征收补偿制度研究[D].华中师范大学,法律,2014,硕士.